Laporan Praktikum Dasa-Dasar Bioteknologi

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM DASAR-DASAR BIOTEKNOLOGI

VISUALISASI EKSTRASI DNA, ANALISIS SEQUEN DNA DENGAN BLAST, PENGOLAHAN DATA HASIL IDENTIFIKASI SEKUEN MENGGUNAKAN PROGRAM BIOINFORMATIKA

 

 

DISUSUN OLEH :

ADINA FETI NURAINI

K2D009067

KELOMPOK 1

JURUSAN ILMU KELAUTAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2011


I.                    PENDAHULUAN

 

1.1  Tujuan

  1. Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana
  2. Melihat presipitasi DNA
  3. Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
  4. Mengetahui cara membuat pohon filogenik yang menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme yang lain

1.2  Manfaat

Manfaat dari dilakukannya praktikum ini adalah:

  1. Mahasiswa dapat diketahui bagaimana cara mengekstraksi DNA
  2. Mahasiswa dapat melihat presipitasi DNA
  3. Mahasiswa dapat mengidentifikasi kekeraban terdekat dari suatu sekuen DNA

II.               TINJAUAN PUSTAKA

2.1  DNA

DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel.

DNA berbentuk polimer panjang nukleotida, mengkode barisan residu asam amino dalam protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida triplet.

DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi.

DNA bukanlah suatu molekul tunggal, nampaknya ia adalah sepasang molekul yang digandeng oleh ikatan hidrogen: DNA tersusun sebagai untai komplementer dengan ikatan hidrogen di antara mereka. Masing-masing untai DNA adalah rantai kimia ?batu bata penyusun?, yakni nukleotida, yang terdiri dari empat tipe: Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G) dan Thymine (T).

DNA mengandung informasi genetika yang diwariskan oleh keturunan dari suatu organisme; informasi ini ditentukan oleh barisan pasangan basa. Sebuah untai DNA mengandung gen, sebagai cetak biru organisme . DNA membuat genom organisme.

Teryata DNA sangat penting , Kalau dalam  kepolisiaan proses identifikasi teroris sangat diperlukan untuk tes DNA, apalagi kalau jasadnya sudah tidak berbentuk manusia lagi.

DNA adalah rangkaian molekul penentu bentuk dan sifat semua makhluk hidup. Semua makhluk hidup punya DNA. Manusia, kucing, monyet, pohon, tomat, pisang, bayam, dinosaurus. Semua punya kode genetik yang menentukan bentuk dan sifat-sifat mereka. Jadi kenapa kita terbentuk seperti manusia, atau tumbuhan berbentuk seperti tumbuhan, atau kenapa kita mirip dengan orangtua kita, dan berbeda dengan orang lain. Ada orang yang berkulit putih, ada yang sawo matang. Ada yang rambutnya bule atau berwarna hitam. Semuanya karena kita mempunyai elemen-elemen pembentuk biologis yang unik, yang namanya molekul DNA itu

DNA adalah resep, skema, sistematika, manual, peta, cetak biru, rancangan, dan informasi biologis yang unik dari makhluk hidup. Persis seperti setiap bangunan gedung yang ada cetak birunya masing-masing. Tidak hanya bentuk fisik makhluk hidup, tapi juga sifat, lewat keturunan. Jadi sifat manusia bisa terbentuk dari 2 hal:

1. Turunan genetik, lewat DNA dari orangtua kita.

2. Unsur lingkungan (Michel Peyrard, 2004)

2.2  BLAST

Perangkat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan pangkalan data sekuens Biologi ialah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Penelusuran BLAST (BLAST search) pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens baik asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.

PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) ialah pangkalan data tunggal yang menyimpan model struktur tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR, dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein atau pun asam nukleat.

2.3  PCR dan ELEKTROFORESIS

2.3.1 PCR

PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan (Brown, 2002).

PCR adalah proses enzimatik dimana suatu area spesifik dari DNA direplikasikan berulang-ulang untuk menghasilkan banyak kopi dari sekuen tertentu. Pengkopian molekuler ini meliputi proses pemanasan dan pendinginan sampel dalam suatu siklus panas tertentu yang melebihi dari 30 siklus (http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/)

Komponen dan Tahapan PCR

Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.

DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.

Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).

Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

Perancangan Primer

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.

Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.

Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.

Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).

Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi (http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/pcr/)

2.3.2 ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis elektroforesis

Perangkat elektroforesis gel.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media (http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis)

2.4  BIOINFORMATIKA

Bioinformatika adalah salah satu cabang baru ilmu biologi yang merupakan perpaduan antara biologi dan teknologi informasi. Menurut Durso (1997) bioinformatika adalah manajemen dan analisis informasi biologis yang disimpan dalam database.

Ilmu ini mengajarkan aplikasi, analisis, dan mengorganisir miliaran bit informasi genetik dalam sel mahluk hidup. Studi bioinformatika terutama didukung uleh studi genomik, biologi komputasi, dan teknologi komputer. Menurut Roderick (lihat Hieter & Boguski, 1997), genomik adalah studi yang berhubungan dengan pemetaan, sekuen, dan analisis genom. Walaupun belum jelas, secara umum Genomik bisa diartikan sebagai penggunaan informasi genom secara sistematis, dengan data eksperimental baru untuk menjawab permasalahan biologis, medis, maupun industri (Jordan, 1999).

Bioinformatika sendiri mencakup kajian yang lebih mendalam dari genomik. Dalam studi bioinformatika digunakan komputer yang mampu menyimpan data dalam jumlah yang sangat banyak dan didukung berbagai macam software untuk menganalisis jutaan data yang berasal dari mahluk hidup.

Perkembangan Bioinformatika

Studi Bioinformatika mulai tumbuh sebagai akibat dari perkembangan berbagai metode sekuens baru yang menghasilka data yang sangat banyak. Hal tersebut, secara kebetulan, didukung pula oleh teknologi penyimpanan, manajemen, dan pertukaran data melalui komputer. Inovasi dalam pemetaan dan sekuensing memiliki peran penting dalam proses pengambilan data biologis. Penggunaan Yeast Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom kompleks secara lengkap (Touchmann & Green, 1998). Untuk mengklon fragmen-fragmen DNA besar (sekitar 150.000 pasangan basa) digunakan bacterial Artificial Chromosome (BAC).

Kemungkinan, teknologi yang paling banyak kontribusinya adalah teknologi PCR. Walaupun tergolong tua (PCR ditemukan tahun 1985), meode ini sangat efektif, dan telah mengalami penyempurnaan selama bertahun-tahun.

Perkembangan teknologi sekuensing dimulai dan semi-automatic sequencer yang pertama pada tahun 1987, dilanjutkan dengan Taq Cycle sequencing pada tahun 1990. Pelabelan Flourescen fragmen DNA dengan Sanger dideoxy Chain Termination Method, merupakan dasar bagi proyek sekuensing skala besar (Venter et. al., 199).

Seluruh perkembangan tersebut sia-sia saja tanpa obyek yang diteliti, yang memiliki nilai komersil tinggi dan data yang berlimpah. Gampang ditebak, pasti Manusia melalui Human Genome Project. Selain perkembangan dalam bidang Genomik, Bioinformatika sangat dipengaruhi oleh perkembangan di bidang teknologi informasi dan komputer.

Pada fase awal (sekitar tahun 80-an) perkembangan yang paling signifikan adalah kapasitas penyimpanan data. Dari hanya baeberapa puluh byte (1980), hingga mencapai Terabyte (1 terabyte=1 trilyun byte), setelah pembuatan database, selanjutnya dimulai perkembangan pemuatan perangkat lunak untuk mengolah data. Awalnya, metode yang digunakan hanya pencariaan kata kunci, dan kalimat pendek. perkembangan selanjutnya berupa perangkat lunak dengan algoritma yang lebih kompleks, seperti penyandian nukleotida, menjadi asam-asam amino, kemudian membuat struktur proteinnya.

Saat ini, perangkat lunak yang tersedia meliputi pembacaan sekuens nukleotida dari gel elektroforesis, prediksi kode protein, identifikasi primer, perbandingan sekuens, analisis kekerabatan, pengenalan pola dan prediksi struktur. Dengan perkembangan seperti diatas, ternyata masih belum cukup. Kurangnya pemahaman terhadap sistem biologis dan organisasi molekular membua analisis sekuens masih mengalami kesulitan. Perbandingan sekuens antar spesies masih sulit akibat variabilitas DNA. Usaha yang dilakukan saat ini, baru mencoba mempelajari eori-teori tersebut melalui proses inferensi, penyesuaian model, dan belajar dari contoh yang tersedia (Baldi & Brunac, 1998).

Perkembangan perangkat keras komputer juga berperan sangat penting. Kecepatan prosesor, kapasitas RAM, dan kartu grafik merupakan salah satu pendorong majunya bioinformatika. Terakhir perkembangan bioinformatika sangat dipengaruhi oleh pertumbuhan jaringan Internet. Mulai dari e-mail, FTP, Telnet (1980-an), Gopher, WAIS, hingga ditemukannya World Wide Web oleh Tim Berners-Lee pada tahun 1990, mendukung kemudahan transfer data yang cepat dan mudah. Saat ini, telah tersedia sekitar 400 database biologis yang dapat diakses melalui internet.

Potensi dan Aplikasi Bioinformatika

Potensi komersial dari aplikasi bioinformatika sangat menggiurkan. Pada tahun 1998 saja, pangsa pasarnya mencapai sekitar $290 juta, dan diperkirakan akan mencapai $2 milyar pada tahun 2005. Selama bulan Maret tahun 2000 investasi pada bidang ini sedikitberkurang. Hal tersebut disebabkan oleh pernyataan Presiden AS Bill Clinton dan PM Inggris Tony Blair, yang membebaskan akses terhadap informasi genom manusia sehingga dianggap menghalangi paten terhadap genom manusia. Tapi, pada akhir bulan, investasi mulai kembali normal karena bioinformatika masih dianggap cukup prospektif di masa depan.

Menurut laporan Ventureone di Amerika Serikat pada tahun 2001 dana-dana ventura telah mencapai $700 juta digunakan untuk pengembangan bioinformatika. Sementara itu, kepala Divisi Teknologi Khusus untuk Bioinformatika yang pertama di Microsoft menganggap, ini adalah peluang yang amat besar. Penjualan komputer untuk ilmuwan-ilmuwan akan mencapai $43 juta.

Beberapa aplikasi bioinformatika

1.      Transformasi sekuen menjadi informasi genetik.

Intinya adalah menjual data, dalam bentuk gen komplit, atau fragmen, yang dapat digunakan oleh pihak lain untuk mencari potensi terhadap gen tersebut.

2.      Pasien sebagai komoditas

Pasien dengan kecenderungan terhadap penyakit tertentu dapat diketahui, sehingga mudah sekali bagi perusahaan oba untuk menawarkan produknya.

3.      Mencari potensi gen

Potensi dari sebuah gen sangat beragam, bergantung pada ekspresi gen tersebut. Aplikasi lebih lanjut dapat berupa transgenik, terapi genetik, atau berbagai rekayasa dan pemanfaatan geneik lainnya.

Permasalahan dan tantangan yang dihadapi

Perkembangan yang sedemikian pesat menghasilkan berbagai teknik dan perangkat baru dalam melakukan manajemen dan analisis data. Karena beragamnya teknik dan perangkat tersebut, terjadi kesulitan dalam perbandingan, penyimpanan, dan analisis data dari berbagai platform (Ladd, 2000).

Usaha standarisasi sedang dilakukan belakangan ini. Salah satu usaha standarisasi yang paling terkenal adalah BioStandard Project yang dilakukan oleh European Bioinformatics Institute (Cambridge, UK). Proyek ini didanai oleh European Bioinformatics Institute, The European Commission, dan beberapa perusahaan farmasi. Dalam proyek tersebut, dilakukan pengembangan perangkat lunak pengolah data yang sesuai dengan standar saat ini maupun masa depan (Murray-Rust, 1994).

Selain standarisasi, bioinformatika juga memiliki masalah lain, yaitu pengolahan data. Saat ini, data yang berhasil dikumpulkan saat ini, sehingga membutuhkan waktu yang sangat lama untuk dianalisis. Data dasar yang diperoleh dari data genomik hanya berupa sekumpulan simbol A, G, T, dan C yang jumlahnya mencapai milyaran bahkan trilyunan. Kesulitannya adalah bagaimana merubah simbol tersebut menjadi -misalnya- gen penyakit asma. Proses menganalisis data genomik menjadi informasi yang dapat dimengerti biasa disebut Data Mining. Dalam proses Data Mining digunakan teknologi pengenalan pola (Pattern Recognition Technology) dan analisis statistika untuk mengolah data dalam jumlah banyak (Wedin, 1999). Tujuan dari Data mining adalah untuk mencari korelasi baru, pola, dan trend.

Permasalahan lain pun muncul menghadang. Sebagai disiplin ilmu yang baru terbentuk, bioinformatika kekurangan SDM yang kompeten. Hal tersebut dijelaskan oleh Craig Benham, seorang Profesor pada sekolah kedokteran Mount Sinai di New York. Ia mengajar bioinformatika aplikasi teknologi informasi. Seperti dijelaskan Benham, ia pada tahun 2000-2001 tidak memiliki murid di program pasca sarjananya. Padahal, diprediksikan bidang ini membutuhkan sekitar 20.000 tenaga kerja terlatih yang kompeten dalam bidang biologi sekaligus ilmu komputer (http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html)

2.5  EKSTRAKSI DNA PROKARIOTIK DAN EUKARIOTIK

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316; Raven & Johnson 2002: 94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176–178).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1).

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl .

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan (http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id)

2.6  POHON FILOGENETIK

Pohon filogenetika atau pohon evolusi adalah diagram percabangan atau “pohon” yang menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan/atau genetik mereka. Takson yang terhubung pada pohon tersebut berarti diturunkan dari satu nenek moyang bersama. Penggambaran pertama pohon ini antara lain ditemukan pada buku Elementary Geology dari Edward Hitchcock (1840) dan The Origin of Species dari Charles Darwin (1859).

Pohon filogenetika ini dapat diaplikasikan untuk membuat sistematika biologi, seperti pohon kehidupan. Selain itu pohon ini dapat digunakan untuk mencari fungsi dari suatu gen atau protein, riset medis dan epidemiologi seperti HIV, dan studi evolusi (http://id.wikipedia.org/wiki/Pohon_filogenetika)

Pohon filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan evolusi diantara berbagai spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik yang berupa diagram bercabang-cabang ini dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola pemotongan enzim restriksi, ukuran allel pada analisa microsatellite, dan lain-lain. Dalam artikel ini kita akan membuat pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA gen 16S ribosomal RNA dari bakteri-bakteri.

Misalkan kita mengisolasi bakteri-bakteri yang hidup di permukaan kulit kita, misalnya ketiak yang kaya akan bakteri golongan Micrococcaceae, kemudian kita mengisolasi DNA genom bakteri-bakteri tersebut secara langsung dan melakukan amplifikasi PCR untuk gen 16S rRNA menggunakan primer universal. Produk PCR tersebut diklon ke plasmid dan setiap klon yang tumbuh dianalisa sekuen DNA insertnya yang notabene adalah sekuen dari gen 16S rRNA bakteri-bakteri yang hidup di dalam tanah sampel kita tadi.

Untuk melihat hubungan kekerabatan antar spesies bakteri yang hidup di permukaan kulit tersebut, kita bisa mengkonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA mereka (http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/)

III.            MATERI DAN METODE

 

3.1. WAKTU DAN TEMPAT

Hari/ tanggal : Jumat, 17 jauni 2011

Waktu           : 10.00 – selesai

Tempat         : Laboratorium Terpadu

3.2. ALAT DAN BAHAN

3.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik (Strawbery)

Alat dan Bahan :

Nama Alat

Fungsi

1.     Tabung sentrifugase 50 ml

2.     Baker glass

3.     Plastik Zip-lock

4.     SaringanUntuk meletakkan larutan juice strawberry serta bahan lainnya.

Untuk mengukur cairan yang akan digunakan.

Untuk tempat strawberry yang akan diremas.

Untuk memisahkan cairan dan ampas strawberry.

Nama Bahan

Fungsi

1.     95% Alkohol (ice cold)

2.     Strawbery

3.     Lysis buffer

4.     Garam iodium

5.     Air destilasi

6.     EnzimUntuk proses visualisasi DNA

Untuk bahan visualisasi pengambilan DNA

Untuk memecah sel DNA

Untuk campuran lysis buffer

Untuk campuran larutan lysis buffer

Untuk mempercepat proses visualisasi DNA

3.2.2. Visualisasi Ekstraksi DNA Prokariotik

Alat dan bahan:

Nama Alat

Fungsi

1.     Tube

2.     Mikro pipet

3.     Jarum oce

4.     Almari pendingin (Freezer)

5.     BunsenUntuk tempat bakteri beserta larutan

Untuk mengambil ukuran larutan

Untuk mengambil bakteri

Untuk membekukan campuran bakteri dengan larutan.

Untuk sterilisasi

Nama Bahan

Fungsi

1.     Bakteri

2.     EnzimUntuk sample

Untuk mempercepat proses visualisasi

3.2.3. Elektroforesis

Alat dan Bahan:

Nama Alat

Fungsi

1.     Tube

2.     Cell elektroforesis

3.     Agar rose

4.     DNAUntuk tempat sampel

Untuk memisahkan fragmen DNA

Untuk meletakkan sampel dalam cell elektroforesis

Untuk sampel

3.2.4. Analisis sequen DNA dengan Blast

Alat dan Bahan:

Nama Alat

Fungsi

1.     Komputer / laptop

2.     Jaringan internetUntuk melihat hasil dari sequen DNA

Untuk dihubungkan ke computer serta sequen DNA

Nama Bahan

Fungsi

1.     Hasil sequen DNA Untuk mengetahui hasil sequen

3.2.5. Pengolahan data hasil identifikasi sekuen dengan menggunakan program bioinformatika

Alat dan Bahan:

Nama Alat

Fungsi

1.     Komputer/ laptop

2.     Softwere ClustalX dan NJ plotUntuk melihat hasil dari sequen DNA

Untuk pengolahan data sequen DNA

Nama Bahan

Fungsi

1.     Hasil – hasil sekuen Untuk hasil dari data

3.3. METODE

3.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik (Strawbery)

1.           Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah/dibagi menjadi 2 bagian

2.           Letakkan sebagian strawberry ke dalam plastik ziplock dan remas-remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice

3.           Tambahkan 10 ml buffer lisis ke dalam plastik dan tutup kembali

4.           Lanjutkan meremas dan ekdtrak yang ada

5.           Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit

6.           Buang saringan dan ekstrak yang ada

7.           Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberry dan larutan

8.           Tuangkan sebanyak 30 ml 95% alkohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml

9.           Lalu tuangkan larutan yang telah disaring ke dalam tabung, tutup tabungnya dan diamati sampai terlihat DNA mulai presipitasi sampai beberapa saat

3.2.2. Visualisasi Ekstraksi DNA Prokariotik

1.           Dalam kondisi aseptis, isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest

2.           Kemudian ambil 1 ose kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut

3.           Suspense bakteri tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer

4.           Diamkan hingga mengkristal

5.           Sementara itu panaskan air hingga suhu air mencapai 90oC

6.           Sementara itu suspense mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit

7.           Ulangi langkah diatas sebanyak tiga kali

3.2.3. Elektroforesis

1.           Gel elektroforesis 2% dimasukkan ke dalam alat Gelmate Elektroforesis

2.           DNA yang terdapat pada tabung tube diambil dengan pipet mikro

3.           Masukkan DNA pada sumur atau lubang elektroforesis yang terdapat pada gel elektroforesis

4.           Nyalakan alat dengan ketentuan voltage dan suhu yang telah ditentukan.

3.2.4. Analisis sequen DNA dengan Blast

1.           Setelah komputer dihidupkan, aktifkan sambungan internet

2.           Cari web BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov./Blast.cgi

3.           Klik nucleotide blast

4.           Enter query sequen dengan cara copy/paste

5.           Kemudian setelah semua perintah dilengkapi klik submit

6.           Tunggu beberapa saat, dan hasil identifikasi sekuen bisa diamati

7.           Catat hasilnya untuk laporan praktikum

3.2.5. Pengolahan data hasil identifikasi sekuen dengan menggunakan program bioinformatika

1.           Simpan data nukleotida bakteri yang akan diolah dalam bentuk txt.

2.           Buka program ClustalX kemudian pilih file kemudian Load

3.           Pilih data yang sudah disimpan kemudian pilih Alignment dilanjutkan Do Complete Alingment

4.           Pilih Tree kemudian seklish exclude, boot strap dan draw N-J tree. Data akan tersimpan dalam bentuk phb, ph dan dnd

5.           Selanjutnya buka program N-J plot

6.           Buka ketiga data yang tersimpan dalam format phb

7.           Setelah data tampil dilanjutkan dengan edit copy untuk memindahkannya ke dalam word.

IV.                HASIL DAN PEMBAHASAN

 

4.1  Hasil

4.1.1         Visualisasi Ekstrasi DNA Eukariotik

Pada isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang-benang putih

4.1.2         Visualisasi Ekstrasi DNA Prokariotik

Pada isolasi DNA prokariot didapatkan dari sampel DNA, dengan suspense mengkristal setelah dimasukkan kedalam freezer

4.1.3         Analisis Sequen DNA dengan Blast

4.1.4        Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sekuen dengan Menggunakan Program Bionformatika

4.2  Pembahasan

4.2.1        Visualisasi Ekstrasi DNA

Praktikum kali ini menggunakan isolasi DNA dari tumbuhan, yaitu strawberry. Hal ini dilakukan karena sel tumbuhan berupa strawberry membrane plasmanya dilindungi oleh dinding sel yang kaku dan untuk mengisolasi DNA dilakukan dengan memecah dinding sel tersebut, sedangkan pada hewan membran plasma merupakan penghalang memisahkan isi sel dan lingkungan ekstraseluler sehingga untuk memisahkan DNA hewan tersebut lebih rumit daripada mengisolasi DNA tumbuhan.

Tekhnik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan organik berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8. Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase. Tetapi pada praktikum ini tidak dilakukan elektroforesis karena keterbatasan alat yang di laboratorium. Sehingga hanya dilakukan isolasi DNA dari strowberry.

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk  penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk mengisolasi dari suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption, liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.

4.2.2        Analisis Sequen DNA dengan Blast

Analisa DNA sequencing merupakan salah satu alat yang digunkan untuk mengetahiu genetik dari makhluk hidup dan mempelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler yang merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science.

Analisis sequen DNA adalah dengan menggunakan BLAST. Denganmelakukan analisis sekuensing dari DNA, maka dapat diketahui dari jenis – jenis bakteri dan sumber atau asal dari suatu bakteri tersebut. Untuk pemilihan bakteri pada analisis sekuensing DNA ini, pemilihanya dilakukan secara random atau acak tidak berdasarkan ketentuan secara urut. Sedangkan untuk penetuan dari sequencing DNA ini diproses dengan progam bioinformatika, dengan progam tersebut maka akan diketahui dari pohon filogenik dari suatu bakteri yang dimasukan kedalam pemrosesan data tersebut. Data dari suatu DNA ini didapat dari GenBank.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain terminationmethod) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaituhanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.

4.2.3        Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sekuen dengan Menggunakan Program Bionformatika

Untuk mengidentifikasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan software bioinformatika yang bertujuan untuk mengetahui tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu mikroorganisme. Dengan pengolahan data dari hasil sekuensing DNA tersebut maka dapat dihasilkan berupa pohon filogenetik.

Bioinformatika menyimpan basis data sekuens biologis berupa basis data primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank.

V.                KESIMPULAN DAN SARAN

 

5.1                   Kesimpulan

Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapakesimpulan yang diantaranya yaitu:

  1. DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik dan yang ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher.
  2. Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino.
  3. Analisa DNA sequencing sangat penting untuk mengetahui genetik kehidupan.
  4. BLAST merupakan alat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengansekuens tertentu yang dimilikinya dan algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.

5.2                   Saran

  1. Ke depannya asisten tetap ramah dan bersahabat dengan praktikan jadi komunikasi antara asisten dan praktikan lancar.
  2. Pengenalan akan peranan dan manfaat praktikum belum sepenuhnya dimengerti.

DAFTAR PUSTAKA

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta

Lehninger,  A.L. 1982. Dasar – dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta

Michel Peyrard, Nonlinear Dynamics and Statistical Physics of DNA, 2004

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta

http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/ (diakses pada 24 Juni 10.40 am WIB)

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada 24 Juni 11.00 am WIB)

http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html (diakses pada 24 Juni 01.00 PM WIB)

http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id (diakses pada 24 Juni 1.20 PM WIB)

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/ (diakses pada 24 Juni 2.10 PM WIB).

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s